Fluxo de trabalho Gradiente para seccionamento CUBE para geração e geração de imagens de organoides com diferenciação localizada

Biologia das Comunicações, volume 6, número do artigo: 299 (2023) Citar este artigo

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Avanços na cultura organoide levaram a vários miniórgãos in vitro que imitam tecidos nativos de várias maneiras. No entanto, o gargalo permanece para gerar organoides complexos com padrões de eixo corporal, bem como manter a orientação dos organoides durante os processos de análise pós-experimento. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para cultivar organoides com gradiente de morfogênio usando um dispositivo de cultura CUBE, seguido de seccionamento de amostras com o CUBE para reter informações sobre a direção do gradiente. Mostramos que os esferóides hiPSC cultivados com dois meios de diferenciação separados em extremidades opostas do CUBO resultaram em expressões localizadas dos respectivos marcadores de diferenciação, em contraste com a distribuição homogênea de marcadores nos controles. Também descrevemos os processos de seccionamento crio e parafina de esferóides no CUBE para reter informações de orientação de gradiente. Este fluxo de trabalho desde a cultura gradiente até o seccionamento com CUBE pode fornecer aos pesquisadores uma ferramenta conveniente para gerar organoides cada vez mais complexos e estudar seus processos de desenvolvimento in vitro.

As células-tronco pluripotentes (PSCs) e os organoides delas derivados oferecem uma maneira pragmática de modelar e estudar a formação de tecidos e órgãos durante o desenvolvimento humano inicial, já que espécimes reais apresentam questões éticas desafiadoras1,2,3,4. Protocolos para gerar os vários organoides que imitam tecidos nativos geralmente dependem da manipulação sequencial da ativação ou inibição de vias de sinalização, como Nodal, Hedgehog, Notch, Wnt ou BMP em diferentes pontos de tempo para induzir diferenciação em linhagens específicas, como no geração de organoides do intestino5, rim6 e pulmão7, epiblastos8,9 e gastrulóides10.

No entanto, controlar o crescimento e a diferenciação de células ao longo de um eixo corporal continua a ser um desafio em culturas organoides 3D. In vitro, os padrões ântero-posterior e dorso-ventral em organoides podem surgir pela auto-organização celular , ou alcançados pela fusão de organoides diferenciados separadamente como um assemblóide, como em organoides cerebrais com diferentes regiões cerebrais ou organoides biliares com fígado, vias biliares componentes do trato e do pâncreas13,14. A limitação destes métodos, porém, é que porque as células são cultivadas num único meio uniforme, o nível de controlo em termos de informação espacial fornecida às células é bastante baixo; todas as células dentro do aglomerado de células que compõem o organoide recebem os mesmos sinais de diferenciação das moléculas sinalizadoras no meio. In vivo, por outro lado, gradientes de concentração de morfogênios de outras fontes também contribuem para determinar para onde vão as células e qual fenótipo ou padrão elas devem adotar durante o desenvolvimento . Por exemplo, a formação do tubo neural depende de sinais da notocorda e da camada do ectoderma não neural17, e os néfrons do rim se desenvolvem pela troca de vários sinais entre o botão uretérico e o mesênquima metanéfrico18. Assim, existe uma necessidade de replicar gradientes de morfogénio para gerar organóides que se assemelhem mais aos tecidos nativos in vivo.

Várias tecnologias de engenharia foram desenvolvidas para imitar o fornecimento de gradiente espacial de moléculas sinalizadoras às células in vitro. PSCs projetados para expressar Sonic Hedgehog (Shh)19 ou esferas de agarose embebidas em morfogênios20 podem ser colocados próximos ao organoide em desenvolvimento e a difusão de moléculas da fonte para as células em diferenciação criou um gradiente de concentração de morfogênios de alto a baixo. Além disso, vários transwells e microdispositivos modificados que permitem que as células sejam cultivadas com dois compartimentos de mídia separados também foram desenvolvidos para gerar gradientes de morfogênio em direções opostas através das células21,22,23,24,25,26. No entanto, estas tecnologias não são isentas de inconvenientes: (1) requerem procedimentos complicados de preparação e configuração que não são fáceis de executar na maioria dos laboratórios de biologia sem competências e equipamentos especializados, (2) falta-lhes controlo sobre a colocação e posicionamento do amostra no dispositivo, e (3) é difícil recuperar a amostra do dispositivo pós-experimento para análises adicionais sem causar muitos danos à amostra ou perder a orientação da amostra. Em particular, a capacidade de reter informações sobre a orientação do gradiente a que as células foram sujeitas é crítica para garantir uma análise adequada da amostra.